夸克乙型肝炎病毒DNA荧光定量检测

种类：	诊断血清	有效期：	12个月
型号：	浙江夸克	规格：	32人份/盒
商标：	浙江夸克	包装：	盒装

产品说明【使用目的和试验原理】本品系采用乙型肝炎病毒特异引物，利用核酸扩增、荧光标记探针，结合TaqmanMGB双探针技术，对人血清或血浆中乙型肝炎病毒核酸（HBVDNA）定量检测，同时对YMDDM位点变异进行检测。可用于临床对乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物的疗效观察。【适用仪器】本试剂盒适用于ABI7000、MJ-II、ABI7900型荧光定量PCR仪及相应软件。【标本要求】用一次性的针筒抽取病人静脉血2ml，置于灭菌的一次性非肝素抗凝试管中，取分离出的血清0.2ml送检。血清标本在2℃～8℃可放置72小时，-70℃可长期保存，标本不宜反复冻融。【试验方法】1.标本、对照品的处理和加样（1）血清标本、试剂盒内阳性对照、阴性对照、YVDD对照、YIDD对照各取50μl（冻存血清或对照品使用前在室温融解，振荡混匀10秒钟），分别加入50μl核酸提取液，振荡10秒，99℃干浴或水浴10分钟，13000rpm离心10分钟，保留上清备用。处理后的样品应在3小时内使用，或在-20℃～-80℃最长保存1个月（不宜反复冻融）。（2）HBVDNA标准品进行10、100、1000倍梯度稀释。（3）取N×36μl混合液与N×0.4μl酶（Taq＋UNG）混匀（N为反应管数），3000rpm离心10秒，取36.4μl上述PCR反应混合液于适当容量离心管中，然后将样品、阳性对照、阴性对照、YVDD对照、YIDD对照处理上清液和梯度稀释的HBVDNA标准品各4μl分别加入离心管中，立即进行PCR扩增反应。2.PCR扩增（1）离心管置于定量荧光PCR仪上，ABI7000、MJ-II、ABI7900循环参数设置：（2）37℃×2min；94℃×2min；再按93℃×15sec→60℃×60sec，循环40次；荧光检测在60℃，反应体系为40μl.（3）荧光通道检测选择：HBVDNA定量检测选用FAM通道，YMDD变异检测选用VIC通道。（4）将定量标准品及各稀释度拷贝数浓度输入仪器软件中。【结果分析】1.质量控制进行定量分析，选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取5-15个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点。阴性对照HBVDNA拷贝数应为UNDET；强阳性对照HBVDNA拷贝数应≥1×106copies/ml、临界阳性对照HBVDNA拷贝数5×103copies/ml～5×104copies/ml，标准曲线相关系数应≤－0.98，否则试验视为无效。进行YMDD变异检测，HBVYMDD弱阳性对照在FAM和VIC通道检测Ct值均应≤38，HBVYVDD血清对照、HBVYIDD血清对照在FAM通道检测所得Ct值应≤38，在VIC通道检测为UNDET，否则试验视为无效。2.结果判断根据工作曲线计算，仪器自动显示待检样品定量值，仪器显示UNDET表示待检样品为阴性。检测样品中5×102copies/ml≤HBV≤5×108copies/ml，测定结果有效，可直接报告相应的拷贝数。检测样品中HBVDNA＞5×108copies/ml，即可直接报告为＞5×108copies/ml，也可用正常人血清按10倍梯度做相应稀释，使其拷贝数落在1×105copies/ml～5×108copies/ml范围内再重新测定，测定结果应以稀释倍数进行校准。检测样本中HBVDNA＜5×102copies/ml时，拷贝数仅供参考，报告为小于最低检测限。待检样品在FAM和VIC通道检测Ct值≤38，判断待检样品为HBVYMDD野生型。待检样品在FAM通道检测Ct值≤38，在VIC通道检测为UNDET，判断待检样品为HBVYMDD变异型。如果检测Ct值在38～40之间，重复检测一次，如果检测Ct值仍在38～40之间，则判为阴性。【对试验结果的解释】乙型肝炎病毒核酸定量值反映病毒在外周血中的浓度，浓度高则传染性强。乙型肝炎病毒YMDD变异情况与该病毒对药物拉米夫定的耐药性直接有关，发生YMDD变异的病毒对拉米夫定可能存在耐药性，结合临床情况综合判断。